急性肝胰腺坏死病AHPND的诊断和治 [复制链接]

摘要：急性肝胰坏死病（Acutehepatopancreaticnecrosisdisease,AHPND）或以前被称为早期死亡综合征（Earlymortalitysyndrome,EMS）是一种新兴的疾病，给水产养殖业带来了重大经济损失。AHPND的主要致病源是副溶血弧菌，一种革兰氏阴性杆状细菌，已获得编码致命二元*素PirA/PirB的质粒，可导致感染虾快速死亡。本文综述了近年来国内外有关虾类AHPND的研究现状和研究进展。还包括了AHPND的分子诊断工具和潜在治疗方法。本综述还包括相关的研究结果，这些结果可作为指导进一步调查和研究AHPND或其他虾类疾病的指南。

关键词:急性肝胰腺坏死病(AHPND)；PirA；PirB；诊断；治疗

1.前言

水产养殖业在全球经济中占有重要地位。这为商业部门提供了就业机会和收入。它的需求逐年增加，而且在很大程度上依赖于人类的消费。在水产养殖业的各个领域中，由于世界各地甲壳类动物市场需求的增加，甲壳类动物产业近年来发展迅速。对虾产业一直被认为是主要的收入来源，许多水产养殖者把养殖对虾作为主要的蛋白质消费来源。虾被认为是市场价值交易中最重要的商品之一。虽然全球养殖虾的产量有所增加，但主要生产国，特别是亚洲，由于虾病的原因产量下降。

水产养殖中最关键的问题之一是各种疾病的发生，威胁着水生动物的健康和生产。海洋动物实际上会在潜在的病原体中游动，使它们容易感染病*、细菌、真菌，甚至原生动物。诸如Taura综合征病*（TSV），传染性皮下和造血病*（IHHNV），白斑综合征病*（WSSV），肝胰腺细小病*（HPV），*头病*（YHV）和斑节杆状病*（MBV）在过去15年中给虾农带来了约亿美元的损失，其中80％的损失仅来自亚洲。疾病的爆发可大大降低不同水生物种的经济增长和养殖量。年，中国新发现一种虹彩病*，导致南美白对虾高死亡率和严重疾病，被证实为虾血细胞虹彩病*（SHIV）。除此之外，还出现了一种名为急性肝胰腺坏死病（AHPND）的传染病，临床表现为虾肝胰腺严重萎缩，并伴有感染急性期独特的组织病理学变化。

AHPND以前被称为早期死亡综合征（EMS），因为它可以导致虾的突然大量死亡，在放养后30-35天内可以观察到，死亡率高达%。这种疾病在斑节对虾（亚洲虎虾）和南美白对虾（白腿虾）中表现出更大的易感性。自年中国首次爆发对虾疫情以来，这些虾种的参与造成了毁灭性的经济损失，每年达数十亿美元，并连续影响到其他东南亚国家，如越南（年）、马来西亚（年）、泰国（年）、菲律宾（年）和墨西哥（年）。为了防止AHPND的爆发，一些国家制定了进口禁令，并加强了进口规则和条件。年，亚太紧急区域磋商，在泰国举行了一次会议，以解决AHPND的潜在风险和严重性，随后在越南举行了次年的技术研讨会。年1月，AHPND被列入世界动物卫生组织（OIE），以便通过更新或报告向其成员国传播信息，避免疾病爆发。

副溶血弧菌是AHPND的致病源，是自然界普遍存在的革兰氏阴性杆状细菌。引起AHPND的副溶血性弧菌对虾有害，但对人类无害。这种细菌产生一种可热溶性溶血素(TLH)诊断标记，而人类产*基因:耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)均为阴性。致病菌含有独特的染色体外质粒，这在非致病性菌株中是没有的。根据地理变异，有两种引起副溶血性弧菌的AHPND。从墨西哥和美国中部分离到的副溶血性弧菌在ORF4位点有一个bp的Tn3-like转座子插入，而在亚洲型(从中国、越南和泰国分离)中不存在。转座子样插入物与AHPND无关，即使在*力质粒上发现，两组间的*力也无差异。致病性弧菌中发现的独特的染色体外质粒编码AHPND主要*力因子的基因，即PirA和PirB*素。尽管发现了少量细菌，但AHPND的致病作用包括萎缩和病变的产生。Lai等人（）的一项研究检测到病虾胃、肝胰腺和血淋巴中蛋白质溶解液中存在PirA和PirB*素。在6小时内，虾肝胰腺明显脱落，并伴有高浓度的PirB。感染后12小时在肝胰腺中检出细菌，而在18小时检测到PirA。肝胰腺脱落和PirB的存在同时发生提供了证据，证明PirB足以引起AHPND感染虾。

在副溶血性弧菌被发现后不久，人们进行了宏基因组测序，以了解对虾的致病机制，并开发诊断工具。此外，还发现一株引起非副溶血性弧菌（V.parahemolyticus）的AHPND菌株V.owensii、V.campbellii和一株接近V.harveyi的菌株具有pVA1样质粒，这意味着这些*素基因可以转移到各种弧菌中。可以假设这些基因在质粒的两侧是移动的遗传元件，这些元件可能是转座酶编码序列，参与水平基因转移。pVA1质粒含有两个质粒动员基因和一组用于接合的转移基因，表明该质粒可能是自我传播的。在表型和基因型水平上具有高度相似性的细菌分支在感染期间通过重组事件、转座、接合和质粒摄取证明了基因转移。这些过程解释了从非致病性菌株向致病性菌株转化的巨大可能性，并积极促进了AHPND的传播。此外，来自墨西哥的副溶血性弧菌（13-/A1和13-D/4）被发现携带编码四环素抗性基因的tetB基因，来自中国的坎贝尔弧菌（Vc3S01）被发现携带多种抗生素抗性基因。如果将传统的疾病管理和根除方法用于AHPND，则会导致疾病控制失败。

年和年发表的综述论文阐述了AHPND的不同方面，涵盖了AHPND的爆发、病因、病原学、目标物种、总体临床体征、组织病理学、潜在治疗、预防以及不同的分子和生物学诊断。然而，这些综述缺乏加速AHPND研究所需的诊断技术的最新信息。本文旨在通过报道AHPND的不同诊断策略和可能的治疗方法，增加相关的知识和发现。其他信息还包括关于该疾病的最新发现，这可以进一步加速发现与AHPND和其他虾病研究有关的致病机制。

2.初步和验证性试验

在水产养殖研究中，诊断是非常重要的，以防止进一步并发症和疾病暴发。预防疾病爆发的初步步骤是分离和鉴定病原体，然后建立不同的诊断平台和工具来鉴定病原体。生物测定法在鉴定疾病的*力和致病性方面非常有帮助。科赫法则常被用作鉴别疾病原因的指南;因此，应该正确地建立病原体和疾病之间无可辩驳的联系。图1为弧菌引起AHPND的诊断流程。

已经进行了许多研究，这些研究使用了挑战性实验来鉴定被测菌株的致病性和*力（表1），这是使用聚合酶链反应（PCR）和病原体的全基因组测序检测到的。

3.临床体征和组织病理学

作为主要的诊断方法，AHPND的临床体征被用来检查受影响的虾。这些早期诊断临床症状必须以亚太水产养殖中心网络（NACA）疾病卡和国际兽疫局（OIE）情况说明书为基础。许多研究表明，受AHPND影响的虾表现为典型的肝胰脏(HP)苍白萎缩和胃、肠道排空。一些行为上的变化，如行动迟缓，螺旋式游泳，减少摄食也被观察到。这些行为特征为该病的推测提供了依据，而组织学检查仍是确认对虾感染的主要方法。疾病早期至中期，AHPND的主要和独特的组织学特征是肝胰腺小管上皮细胞脱落和大量变圆，未发现致病病原体。这些特征对于诊断至关重要，建议从任何可疑池塘中收集并检查10个或更多虾标本，以确保在该疾病阶段至少有一个标本。这是一种合理的方法，因为在AHPND的初始阶段，疾病的特点是B（水泡样）、F（纤维）和R（吸收）细胞的中远端功能障碍，显著的核仁肿大，E细胞（胚胎）缺乏有丝分裂活性。由大量继发感染描述的末期可能很难评估。例如，该疾病的晚期以血细胞的巨大聚集和黑色素肉芽肿的出现为特征，并伴有小管腔内不同细菌的许多菌落的感染。感染虾中的这些表现很难与各种细菌种类的非AHPND分离物带来的严重感染和其他常规感染区分开来。

疑似样品，如虾、沉积物或饲料，必须用戴维森的AFA固定剂进行1-2天的光镜检查，并用苏木精和伊红染色。除了光学显微镜外，透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）也可以用来检查样品。

4.聚合酶链反应和环介导等温扩增方法

PCR作为一种检测病原体的诊断工具已被用于许多病理学研究，也可用于检测AHPND疑似标本。PCR引物针对样本中存在的特异DNA序列检测AHPND。针对AHPND的DNA序列的AHPND引物组1（AP1）和AHPND引物组2（AP2）是年首次使用的PCR诊断工具。年，Flegel和Lo（b）使用了三组AHPND引物（AP1、AP2和AP3），但由于缺乏*素基因的质粒突变，发现了来自AP2的假阳性结果。在三组AHPND引物（AP1、AP2和AP3）中，AP3的敏感性和特异性最高。此外，Tinwongger等人（年）使用TUMSAT-Vp3引物靶向AHPNDDNA序列。改进的巢式PCR方法(AP4)灵敏度更高，提取DNA前不需要预富集培养，但AP4能扩增副溶血性弧菌的PirA和PirB基因，仅能检测出含有这两种基因的AHPND菌株。在最近的PCR方法中，以PirA副溶血性弧菌为靶点的AP3引物被认为是最有希望检测AHPND的工具，因为它具有较高的敏感性和特异性。因此，使用能够检测PirA基因的AP3引物和双链PCR方法检测PirA和PirB基因是AHPND检测最推荐的验证性试验（表2）。这些方法的特异性和敏感性尚需进一步的比较研究。

一种大约bp的Tn3样转座元件，负责PirA和PirB样二元*素的分泌，仅在墨西哥和中美洲其他国家的AHPND菌株中发现，而在泰国、中国和越南分离的东南亚菌株中却没有发现。因此，Han等人（b）开发了一种PCR方法来检测这些分离株中的这些差异。并利用Han等人（c）建立了定量PCR方法（qPCR），对其*力进行定量分析，并对AHPND进行特异性和高灵敏度检测。另一种可靠且方便的检测方法是环介导等温扩增(loop-meditatedisothermalamplification,LAMP)，它产生的结果易于解释，适合于检测AHPND的早期发作(表3)。此外，最近的研究能够开发出一种现场检测副溶血性弧菌AHPND的方法。同时采用PCR-DNA层析法和多重PCR方法对AHPND、传染性皮下和肝胰腺坏死感染、肝肠胞虫和白斑病进行了鉴别。

5.生物传感器

生物传感器是另一种新兴的诊断工具，可用于检测病原体。它产生与被分析样品（病原体、生物/细胞物质或*素）成正比的可量化信号。生物传感器在疾病诊断中的应用越来越广泛。它的检测可以基于化学反应、电信号或通过蛋白质或核酸成分相互作用产生的光信号。生物传感器按其传感机理分为光学传感器、电化学传感器、机械传感器和电传感器。根据受体的作用机理，它也可以被分为亲和型和催化型生物传感器。疾病相关蛋白的检测需要特异性、敏感性和成本效益。许多生物传感器被开发用于检测特定的分子，每一个都有自己的特异性和组成部分。生物传感器是一种分析设备，包括一个传感元件和一个电子传感器，以测量使用电子输出的生物事件。生物传感器在其设置中包括聚合物支撑物，这些支撑物通常是固态的。该聚合物可以是亲水的或疏水的，这取决于将哪种类型的受体固定在其表面上。例如，使用亚甲基蓝固定氧化石墨烯的电化学免疫传感器用于检测虾和螃蟹样品中的WSSV。该方法的优点是它提供了来自组织的WSSV的电化学免疫感应。另一种生物传感器利用DNA肖特基二极管衍生的DNA的电子特性，用于检测不同虾类样品中的病*和细菌。该方法可作为非实验室诊断和病理学研究的依据。到目前为止，还没有建立用于AHPND检测的生物传感器。基于DNA的生物传感器在AHPND的诊断中表现示出良好的应用前景，但还需要更多的研究来开发AHPND诊断的免疫传感策略。

6.环境DNA

环境DNA(EnvironmentalDNA,eDNA)是生态学研究的重要工具，有助于生物多样性的监测和入侵物种的检测。由于生物之间相互作用，DNA会脱落，并在海洋生态系统中进行检测和量化。eDNA被广泛使用，因为早期检测病原体可以阻止进一步使用动物样本；然而，还没有开发出用于AHPND检测的工具，需要进一步研究以建立预防AHPND疾病爆发的诊断工具。

7.潜在的治疗方法

7.1噬菌体疗法

在水产养殖中使用抗生素是治疗弧菌最常用的方法；然而，随着药物可能在环境中传播，抗生素耐药性成为主要问题。噬菌体/噬菌体疗法是一种很有前途的预防和治疗水产养殖弧菌病的方法。噬菌体疗法在日本首次被引入，主要用于治疗格氏乳球菌。从那时起，它一直是科学界的一个重大课题。一些研究使用噬菌体治疗弧菌病的不同病原体(表4)。为了评估该方法的有效性，Lomeli?-Ortega和Marti?nezDi?az（）发现，在感染后6小时施用溶血性噬菌体A3S和Vp1可有效降低副溶血性弧菌引起的南美白对虾的死亡率。使用超过6小时的噬菌体可以降低死亡率和疾病进展。但本研究是在限菌的条件下进行的，需要建立模型来检验不同的外部因素如水质和有机物的数量对噬菌体治疗效果的影响。最近，一项针对南美白对虾的噬菌体实验表明，对副溶血性弧菌AHPND攻击试验具有显著的保护作用和存活率。由于AHPND疾病发展迅速，因此正确的时机或频繁进行噬菌体治疗可能是治疗的必要方法。因此，需要更多的研究来建立正确的噬菌体治疗AHPND疾病进展的模型，寻找最佳的治疗剂量和治疗方案。

7.2益生菌

维持池塘和虾的胃肠道中藻类和细菌之间的生物平衡是减少AHPND感染的途径之一。这些微环境在许多重要的功能中发挥作用，如直接和间接的免疫反应和营养物质的消化。使用益生菌来抑制虾体内某些细菌的感染是有效的，并提高了水产养殖的水质。益生菌处理，例如使用干酪乳杆菌、假单胞菌和酿酒酵母，对AHPND的虾生存率各不相同，其中酿酒酵母表现出最高的虾生存率，同时又保持了虾在胃肠道中的微生物菌群。目前还不清楚实际的益生菌或它们的天然产物是否确实抑制了水产养殖池塘中的某些致病性微生物，如弧菌。紫色非硫细菌(PNSB)在水环境中普遍存在，通常在虾养殖场中被发现，它们已被证明可以促进其他海洋生物的生长。目前，PNSB产生的抗弧菌化合物的研究还很少。然而，一些生物活性化合物已经被证明是由紫细菌抗费氏弧菌和哈维氏弧菌产生的。据报道，乳酸菌（LAB）具有免疫调节功能，并已应用到南美白对虾养殖中。从虾肠道分离的植物乳杆菌菌株SGLAB01和乳酸乳球菌菌株SGLAB02具有抗菌活性，对虾体内AHPND的感染具有保护作用。上述研究结果可用于进一步改进益生菌技术和利用植物乳杆菌和乳酸乳球菌作为饲料添加剂，在不影响宿主免疫应答的情况下提供抗AHPND的保护。最近的研究表明，从南美白对虾的后肠中分离出的益生菌CDA22和CDM8对AHPND具有良好的生物防治作用。例如，CDA22和CD8可以减少副溶血性弧菌致病基因PirA的拷贝数。然而，当CDA22和CD8联合使用时，没有观察到保护作用。可能需要对参与竞争或拮抗的分子机制进行研究，以便为这些观察结果提供适当的解释。目前，关于不同益生菌在水产养殖中对虾的保护协同作用的研究资料非常有限。未来的研究方向将集中在代谢途径和功能基因的分子分析上，有助于更深入地理解环境微生物生态系统多样性和海洋动物整体健康的意义。因此，确定有助于改善虾类养殖环境和健康的微生物，并分析这些微生物与宿主之间的联系至关重要。

8.免疫致敏

无脊椎动物，包括虾，被认为缺乏真正的淋巴细胞和高级的体液免疫反应。它们主要依靠自身固有的或非特异性的免疫，作为抵御病原体的主要和唯一的保护。脊椎动物具有免疫记忆，通过抗原很容易识别特定病原体，并通过克隆扩增产生效应细胞和记忆细胞，而非适应性无脊椎动物对微生物病原体的存活时间仅为几分钟，这在现代进化论下受到质疑。最近，有关在应用疫苗后，提高无脊椎动物免疫力的研究，支持了适应性免疫的可能存在。

免疫致敏是一种两步免疫技术，将病原体引入宿主系统，然后进行二次免疫或感染同一病原体。在甲壳类动物中，将WSSV重组病*蛋白引入枯草芽孢杆菌孢子后，南美白对虾免疫致敏，引起对WSSV较高的吞噬活性。使用福尔马林灭活弧菌疫苗接种的斑节对虾，其对弧菌的免疫力显示产卵后的存活时间更长。在南美白对虾的虾苗和较大幼体上也观察到针对细菌病原体的增强的免疫力。更大的幼体暴露于福尔马林灭活的哈维氏菌可通过选择性增加吞噬和血细胞百分比来增强天然抗菌活性。在对虾中，对最初产生抗原的病原体表现出更高的抗性或耐受性，这表明免疫致敏的保护作用仅针对初次接种期间使用的病原体类型和菌株。免疫特异性更容易对通常感染宿主的本地或天然病原体作出反应。与拥有数百万抗体的下颌脊椎动物相比，它对其他病原体缺乏反应，呈现出较低数量的免疫受体。免疫致敏被认为既不是普遍的，也不是特异的，而是一种选择性免疫。

进一步的研究集中在开发针对引起AHPND的溶血性弧菌疫苗。由于虾类缺乏适应性免疫系统，被动免疫可能通过口服特异性卵*粉（IgY）对虾类弧菌病起到保护作用，体外试验结果表明，被动免疫能抑制副溶血性弧菌和哈维氏弧菌。相关研究表明，特异性IgY能有效地抑制副溶血性弧菌的生长，并对对虾提供被动免疫。最近，通过对LpxD基因的敲除，副溶血性弧菌的*性被削弱，并在对虾中提供了大量的保护。该方法可用于减**性细菌，开发抗副溶血性弧菌的减*活疫苗。由于副溶血性弧菌的A和B*素可引起AHPND，因此开发了针对A和B*素的单克隆抗体，这些单克隆抗体可用于斑点印迹法检测*素。虽然所生成的单克隆抗体已被证明能有效检测*素A和B，并作为治疗药物，但它们还没有被证明能有效治疗/治愈AHPND。

截至目前，尚无针对AHPND的商业虾疫苗可用。但是许多研究试图利用副溶血弧菌抗原开发针对这种病原菌的疫苗。一些研究在饲料中使用了抗PirA样*素IgY，并表现出针对AHPND的被动免疫。这种在饲料中添加抗PirAIgY的方法可能是针对AHPND感染的有效预防方法。需要解决的难点是副溶血性弧菌疫苗的研制。AHPND疫苗的研究进展是一项重要的议题，因为进一步研究AHPND的潜在机制和发病机理需要更好地了解该病。受体、*素或致病基因与现有的知识和技术相结合，可使疫苗研究加速并进一步推进AHPND研究。

9.结论

自年中国爆发AHPND以来，开始并实施了控制措施，以控制和根除该病。许多分子诊断工具已被开发和实施，以减少AHPND爆发的影响。其中一些有可能被用于现场帮助农民诊断AHPND，但更大的问题仍然是如何预防和治疗AHPND。一些关于开发治疗药物的研究有可能控制疾病并可能预防疾病爆发。由于虾类缺乏一种对防治AHPND等传染病至关重要的适应性免疫应答，因此必须进一步研究虾类的免疫应答及其机制。这些对于开发针对AHPND和其他虾类疾病的疫苗和治疗方法至关重要。关于AHPND，需要进一步研究PirA和PirB样受体，因为与宿主生物的相互作用机制以及发病机理可能被证明对AHPND预防研究有用。了解疾病和致病性的潜在机制对于预防和根除AHPND至关重要。关于AHPND的所有实验都必须遵循实验室安全和生物安全规程，以确保其人员的安全并防止传染性物质扩散到与AHPND相关的环境中。鉴于AHPND是一种新近出现的疾病，对该疾病的生物监测、治疗、诊断和管理是许多人面临的巨大困境。

参考文献

HarveyMSantos,Ching-YiTsai,KenthRogerAMaquiling,LemmuelLTayo,AbdulRMariatulqabtiah,Chi-WenLee,KuoPinChuang.Diagnosisandpotentialtreatmentsforacutehepatopancreaticnecrosisdisease(AHPND):areview.AquacInt.;28(1):-.doi:10.7/s---w.

图1.AHPND感染样品检测及处理工艺流程图

表1.AHPND的感染途径及检测方法

表2.检测AHPND的PCR方法

表3.检测AHPND的LAMP方法

表4.抗弧菌的噬菌体疗法

本文由龙岩学院生命科学学院王鑫翻译与整理。